Окончил 1-ю киевскую гимназию с золотой медалью (1894), Военно-медицинскую академию в СПб. (1899), оставлен для подготовки к профессорскому званию. Доктор медицины (1902, Военно-медицинская академия), диссертация «О мозговых центрах, управляющих эрекцией полового члена и семяотделением». Работал в клинике Женского медицинского института в СПб. (1903—13). Участник Русско-японской войны. Одновременно с 1907 приват-доцент Военно-медицинской академии, вплоть до 1914 читал лекции по невропатологии и специальный курс хирургического лечения нервных больных. В 1904—07 секретарь Русского общества нормальной и патологической психологии. Работал вместе с В.М. Бехтеревым, считал его своим учителем. В 1908 основал вместе с ним первую в России нейрохирургическую клинику в Психоневрологическом институте в СПб. и возглавил ее. В 1910—20 профессор невропатологии и декан медицинского факультета этого института. Первый ректор Государственного института медицинских знаний в Петрограде. В 1920 оптировался в Эстонию. С декабря 1920 профессор неврологии Тартуского университета (до 1942), руководил университетской клиникой нервных болезней. Один из основателей Общества эстонских неврологов, Общества по борьбе с раковыми заболеваниями, Французского института в Тарту (1922), ж. «Folia Neuropathologica Estoniana» (1923) и Эстонского общества духовного здоровья. Активно участвовал в работе Международной комиссии психологического сотрудничества, член Международного антиалкогольного научного комитета. Консультант-невропатолог вооруженных сил Эстонии, с 1921 генерал-майор санитарной службы. Член Русской академической группы. Почетный доктор Падуанского университета (1922), Виленского университета (1929), Академии наук в Ферраре (1938), член-корреспондент Португальской Академии наук (1929) и Медицинской академии в Турине (1934), иностранный член Парижской хирургической академии (1935). С 1938 академик первого состава Эстонской Академии наук. Почетный член и член-корреспондент множества научных обществ. Публиковался во многих международных научных журналах, член их редколлегий.

Похоронен в Тарту на кладбище Раади.

Фотопортрет и фото захоронения любезно предоставлены М. А. Акименко.

Соч.: Иннервация предстательной железы. Экспериментальное исследование. СПб., 1902; Хирургия при душевных болезнях. СПб., 1908 (с В.М. Бехтеревым); Оперативное лечение опухолей головного мозга. СПб., 1914; Травматический невроз военного времени. (Клинический очерк на основании собственных наблюдений). Пг., 1916; Основы хирургической невропатологии. В 4 ч. Ч. 1. Пг., 1917; Die Tumoren des Gehims, ihre Symptomatologie, Diagnostik und operative Behandlung. Tartu, 1927; Chirurgische Neuro-pathologie. 3 т. Tartu, 1932—1939; Peaaju, tema töö ja tervishoid. Tartu, 1941; Linnamägi Ü. (Comp.) Ludvig Puusepp 125 Collected papers. Tartu, Tallinn, 2000.

Лит.: Материалы конференции, посвященной 100-летию со дня рождения проф. Л.М. Пуусеппа. Тарту, 1975; Мирский М.Б. Медицина России X—XX веков: Очерки истории. М., 2005. С. 483, 544—551; Танклер Х.Л. Выходцы из России — преподаватели Тартуского университета 1919—1940 гг. // Биографика. I: Русские деятели в Эстонии ХХ века. Тарту, 2005. С. 61—63; Акименко М.А. Институт им. В.М. Бехтерева: от истоков до современности (1907—2007 гг.). СПб., 2007. С. 9 и др.; Сорокина М.Ю. Материалы для биобиблиографического словаря «Российское научное зарубежье». Пилотный выпуск 1: Медицинские науки. XIX — первая половина ХХ в. М., 2010. С. 174—175; Raudam E., Soomere I. Ludvig Puusepp. Tallinn, 1977; Kaude J. Research and Science in Medicine at the University of Tartu, 1802—1940: A Forgotten Era in the History of Medicine // Journal of Baltic Studies. 1988. Vol. 19, №. Р. 137—140; Lichterman B. L. On the History of Psychosurgery in Russia // Acta Neurochirurgica. Wien, 1993. Vol. 125, № 1/4. Р. 1—4; Lichterman B.L. Roots and Routes of Russian Neurosurgery // Journal of  History of Neuroscience. 1998. Vol. 7, № 2. P. 125—35; Linnamägi Ü. Ludvig Puusepp 125. Tartu, Tallinn, 2000.